Laboratorijska dijagnostika lizosomskih bolesti nakupljanja: nove mogućnosti

Posljednjih godina ostvaren je značajan napredak u liječenju nekih lizosomskih bolesti nakupljanja (Gaucherova bolest tipa I., Fabryjeva bolest, Mukopolisaharidoza tipa I., Pompéova bolest). U radu se razmatraju mogućnosti praćenja tijeka liječenja bolesnika na enzimskoj nadomjesnoj terapiji uz pomoć odgovarajućih biljega, kao i nove laboratorijske mogućnosti novorođenačkog probiranja lizosomskih bolesti nakupljanja UVOD
Zanimanje za skupinu lizosomskih bolesti nakupljanja u posljednje je vrijeme u izuzetnom porastu. U prilog tome govori i 42. kongres o nasljednim metaboličkim bolestima (Pariz, 2005.), na kojemu je većina tema bila posvećena rezultatima dosadašnje enzimske nadomjesne terapije, najavama novih terapijskih pristupa, laboratorijskom praćenju tijeka liječenja te mogućnostima ranog otkrivanja ove skupine nasljednih metaboličkih bolesti. U drugom dijelu ovog broja časopisa detaljno su obrađeni mogući pristupi lije- čenju lizosomskih bolesti nakupljanja. Dosadašnja su iskustva pokazala da je pravodobno postavljena laboratorijska dijagnoza jedan od osnovnih preduvjeta uspješnog ishoda bilo kojeg pristupa lije- čenju. U Kliničkom zavodu za laboratorijsku dijagnostiku Kliničkog bolničkog centra Zagreb i Medicinskoga fakulteta Sveučilišta u Zagrebu od 1994. godine provodi se laboratorijska dijagnostika lizosomskih bolesti nakupljanja u sklopu selektivnog traganja za nasljednim metabolič kim bolestima. Osnovna načela i problemi takvog načina dijagnostike, od postavljene kliničke sumnje preko pretra- živanja nerazgrađenog supstrata do dijagnostič kih pretraga i testova potvrde, opisani su u prošlogodišnjem broju ovog časopisa (1).
Ovim se člankom želi uputiti na nove izazove s kojima je suočen laboratorij u vrijeme kad je enzimska nadomjesna terapija postala stvarnost i za naše bolesnike.

BILJEZI ZA PRAĆENJE ENZIMSKE NADOMJESNE TERAPIJE
Uvođenjem enzimske nadomjesne terapije u liječenje bolesnika s Gaucherovom bolešću tipa I. neizostavno je bilo redovito praćenje tijeka liječenja. Uz klinič ku, radiološku i hematološku obradu u laboratoriju se mjerila aktivnost angiotenzin- konvertirajućeg enzima, kisele fosfataze i ukupne _-heksozaminidaze. No ti biokemijski parametri nisu bili pouzdani pokazatelji tijeka liječenja. Godine 1994. opisan je enzim hitotriozidaza čija je aktivnost u serumu bila i do 1000 puta viša u bolesnika s Gaucherovom bolešću u odnosu na kontrolnu skupinu ispitanika (2). Hitotriozidazu u cirkulaciju izlučuju patološ ki promijenjeni aktivirani makrofagi (Gaucherove stanice). Katalitička aktivnost tog enzima može se mjeriti u serumu uz specifični sintetski supstrat, a ona ujedno dobro i brzo odražava patološke promjene u cijelom organizmu. Ta su svojstva uvjetovala uvođenje hitotriozidaze kao prvog “biomarkera“ u praćenju liječenja lizosomskih bolesti nakupljanja. Intenzivna istraživanja u području lije- čenja ove skupine nasljednih metabolič kih bolesti, kao i dostupnost enzimske nadomjesne terapije za neke bolesti nakupljanja, pojačala su potrebu za pronalaž enjem odgovarajućih novih biljega. Važno je napomenuti da kontinuirano praćenje promjena takvih biljega ima jednu od odlučujućih uloga u korekciji doze, što može utjecati na smanjenje troškova za te inače vrlo skupe lijekove. S biokemijskog stajališa biljezi mogu biti nerazgrađeni, specifični supstrati koji zaostaju u lizosomima stanica zbog smanjene aktivnosti promijenjenog lizosomskog enzima ili molekule koje odražavaju primarne promjene određene lizosomske bolesti nakupljanja.
No da bi bili primjenjivi u kliničkoj praksi, takvi "idealni biomarkeri" trebaju zadovoljiti niz uvjeta: mogućnost jednostavnog mjerenja u krvi ili mokraći; promjene u koncentraciji trebaju odražavati stanje bolesti u cijelom organizmu, a ne samo u određenim organima; trebaju biti specifično promijenjeni samo u određ enoj bolesti; promjene u koncentraciji trebaju pratiti klinički tijek bolesti. Sve spomenute uvjete zasad u potpunosti ne zadovoljava niti jedan biljeg koji služi u dijagnostici i praćenju tijeka liječenja lizosomskih bolesti nakupljanja.

B i o m a r k e r i u k l i n i č k o j p r a k s i
Mjerenje katalitičke aktivnosti enzima hitotriozidaze u serumu već se više od deset godina uspješno primjenjuje u dijagnostici i praćenju liječenja Gaucherove bolesti tipa I. (3). Novija istraživanja pokazala su da Gaucherove stanice izlučuju i kemokin CCL18, također poznat kao PARC (engl. pulmonary and activation- regulated chemokine). Koncentracija CCL18 može se mjeriti imunokemijskim metodama u serumu, a u simptomatskih bolesnika s Gaucherovom bolešću povi- šena je od 10 do 50 puta (4). Rezultati praćenja tijeka liječenja bolesnika s biljezima hitotriozidazom i CCL18 dali su gotovo iste rezultate (5). Zbog znatno većih troškova u laboratorijskoj dijagnostici, primjena CCL18 opravdana je jedino u bolesnika s Gaucherovom bolešću koji imaju genski uvjetovan nedostatak aktivnosti enzima hitotriozidaze. Naime, oko 5-6% sveukupne populacije ima duplikaciju od 24 para baza u genu za hitotriozidazu, što onemogućuje stvaranje aktivnog enzima.
Za laboratorijsko praćenje tijeka lije- čenja mukopolisaharidoze tipa I. enzimskom nadomjesnom terapijom jedini zasad dostupan biljeg su glikozaminoglikani u mokraći. Dosadašnji rezultati pra- ćenja tih bolesnika pokazali su da izmjerene vrijednosti ukupnih glikozaminoglikana nisu pouzdan pokazatelj koštanih promjena i stanja lokomotornog sustava (6). U razvoju su imunokemijske metode za mjerenje koncentracije dermatan-sulfata i keratan-sulfata, čiji bi međusobni odnosi trebali bolje pratiti promjene u tijeku liječenja bolesnika s mukopolisaharidozom tipa I., a uskoro tipa II. i tipa VI. U Fabryjevoj bolesti nakupljanje globotriaozilceramida (Gb3) u lizosomima nastaje kao posljedica nedostatne aktivnosti enzima _-galaktozidaze A. Svi zahvać eni muški bolesnici imaju značajno sniženu aktivnost tog enzima (7). Važno je napomenuti da se različiti oblici klinič ke slike Fabryjeve bolesti mogu pojaviti i u žena heterozigota, koje imaju izmjerenu enzimsku aktivnost u granicama referentnog raspona (8). U takvim slučajevima za postavljanje dijagnoze nije dostatno mjerenje katalitičke aktivnosti lizosomskog enzima _-galaktozidaze A u homogenatu leukocita. Ako postoji klinič ka sumnja, u tih je bolesnica potrebno sekvencirati gen za _-galaktozidazu A zbog više od 270 dosad poznatih promjena u genu (9). Druga mogućnost potvrde heterozigotnosti je mjerenje karakteristič nih globotriaozilceramida u uzorcima urina uz pomoć elektrosprej-tandemske spektrometrije masa (10). To je ujedno i jedini za sada dostupni laboratorijski biljeg praćenja djelotvornosti enzimske nadomjesne terapije u bolesnika s Fabryjevom bolešću. Novija istraživanja upozoravaju i na nedostatke tog biljega: Gb3 nije pouzdan u praćenju bolesnika koji imaju mutaciju N215S, kao ni u žena koje prije liječenja nemaju povišenu koncentraciju Gb3 u plazmi. Isto tako postoje bolesnici u kojih, zbog još nepoznatih razloga, sniženje Gb3 ne prati poboljšanje klinič ke slike (11).
Enzimska nadomjesna terapija dostupna je i za liječenje Pompéove bolesti. Mjerenje specifičnih nerazgrađenih oligosaharida (tetrameri glukoze) primjenjuje se u ranoj laboratorijskoj dijagnostici i praćenju tijeka liječenja Pompéove bolesti. Kako se tetrameri glukoze nalaze u izuzetno niskim koncentracijama u biološ kom materijalu, za njihovo mjerenje najbolja je tandemska spektrometrija masa. Važno je napomenuti da se promjene tih oligosaharida trebaju isključivo pratiti u uzorcima urina, a ne plazme ili suhe kapi krvi na filtar-papiru (12). Potraga za “idealnim biomarkerima“ na području lizosomskih bolesti nakupljanja nalazi se u punom zamahu. Dosadaš nji napori nisu dali zadovoljavajuće rezultate, a nove nade i izazove u tom područ ju pružaju tehnologije u području proteomike.

RANA DIJAGNOSTIKA LIZOSOMSKIH BOLESTI NAKUPLJANJA
S obzirom na dosadašnji tijek razvoja novih oblika liječenja nekih lizosomskih bolesti nakupljanja, u idućih nekoliko godina možemo očekivati još veće zanimanje za ovu skupinu nasljednih metaboličkih poremećaja. Učinkovitost novih oblika liječenja, posebice u onih lizosomskih bolesti nakupljanja gdje je zahvaćen središ nji živčani sustav i gdje su prisutne promjene u kostima, ovisit će o rano postavljenoj dijagnozi i početku liječenja prije pojave nepovratnih promjena. Dosadašnja strategija laboratorijske dijagnostike lizosomskih bolesti nakupljanja odvija se u sklopu selektivnog traganja. Takav program temelji se ponajprije na kliničkom prepoznavanju, odgovarajuć oj specijalističkoj obradi te konačnoj potvrdi dijagnoze u specijaliziranim laboratorijima. Ovisno o vrsti lizosomske bolesti i kliničkoj slici bolesnika, dijagnoza se obično postavlja u dobi od nekoliko mjeseci pa do nekoliko godina. Zbog spomenutog tijeka dijagnostike, posljednjih je godina sve više radova koji govore o potrebi što ranijeg postavljanja dijagnoze i mogućnostima uvođenja lizosomskih bolesti nakupljanja u posebne programe novorođenačkog probiranja. Razvoj novih laboratorijskih metoda omogućio je "tehničku izvedbu" takvog koncepta, no ne bi se smjelo dopustiti da to bude ključno u stvaranju novoga pristupa laboratorijskoj dijagnostici te skupine nasljednih metaboličkih poremećaja.

L a b o r a t o r i j s k e m o g u ć n o s t i n o v o r o đ e n a č k o g p r o b i r a n j a l i z o s o m s k i h b o l e s t i n a k u p l j a n j a
Prvi pokušaji novorođenačkog probiranja lizosomskih bolesti nakupljanja temeljili su se na zajedničkim biokemijskim svojstvima ove skupine nasljednih metaboličkih poremećaja: nakupljanju specifičnog, nerazgrađenog supstrata u lizosomima stanica.
Postupno nakupljanje makromolekula različite biokemijske strukture u lizosomima uzrokuje značajan porast broja i veličine tih organela te razmjerno tome pripadajućih lizosomskih membranskih proteina (engl. LAMP, lysosome associated membrane proteins).
Sama uloga tih glikoziliranih proteina još nije u potpunosti poznata, no oni čine oko 50% proteina u membrani organele. Razvijeni, osjetljivi imunokemijski testovi omogućili su mjerenje dijagnostički važnih proteina iz suhe kapi krvi na filtar- papiru. Najopsežnije pokusne studije provođene su u Australiji i rezultati su pokazali da najpouzdanije nalaze u takvom pretraživanju daje mjerenje proteina LAMP-1 u kombinaciji sa sapozinom C. No, spomenutim postupkom bilo je moguć e izdvojiti samo skupinu visokorizič ne novorođenčadi za neke od lizosomskih bolesti nakupljanja (13, 14). Još relativno nova tehnologija, tandemska spektrometrija masa, omogućila je proširenje novorođenačkog probiranja na više od 20 nasljednih metaboličkih bo- lesti (15). Mogućnosti te tehnologije koriste se na razne načine i u pokusnim programima novorođenačkog probiranja lizosomskih bolesti nakupljanja. Dosadaš nji programi ograničili su se uglavnom na lizosomske bolesti nakupljanja za koje postoji, ili je u fazi kliničkog ispitivanja, neki od oblika liječenja: Gaucherova bolest, Pompéova bolest, Fabryjeva bolest, Niemann-Pickova bolest tipa A i B, mukopolisaharidoze tipa I., II. i VI. U tih bolesnika pokušaji mjerenja količine specifič nog, nerazgrađenog supstrata u uzorcima suhe kapi krvi i urina pomoću elektrosprej- tandemske spektrometrije masa nisu dali zadovoljavajuće rezultate (16). Novija su istraživanja usmjerena na metode koje se provode kao kombinacija specifične enzimske reakcije sa sintetskim supstratom i mjerenja količine stvorenoga reakcijskog produkta uz elektrosprej- tandemsku spektrometriju masa. Takav pristup omogućuje procjenu katalitič ke aktivnosti do šest različitih lizosomskih enzima iz uzorka jedne suhe kapi krvi na filtar-papiru (17). Proces je moguć e u potpunosti robotizirati, no ne i uklopiti u postojeće novorođenačke programe probiranja koji se provode uz sličnu tehnologiju.
Dosadašnje iskustvo s primjenom tandemske spektrometrije masa u novoro- đenačkom probiru pokazalo je da je trebalo proći više od 10 godina od pokusnih studija do uvrštavanja u nacionalne programe novorođenačkog probiranja. Mi- šljenja stručnjaka o toj problematici u pojedinim zemljama još se bitno razlikuju. No sama mogućnost predsimptomatske dijagnostike lizosomskih bolesti nakupljanja otvara niz ozbiljnih etičkih dilema i potrebno je u raspravu aktivno uključiti sve koji skrbe za takve bolesnike u pojedinoj zemlji.

LITERATURA
1. Fumić K, Barić I, Mrsić M, Maradin M. Lizosomske bolesti nakupljanja - suvremena dijagnostika i nove metode liječenja. Paediatr Croat 2004; 48(Supl 1):160-8.
2. Hollak CE, van Weely S, van Oers MH, Aerts JM. Marked evaluation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. J Clin Invest 1994;93:1288-92.
3. Bagganger JA, Rourke E. Lessons learned from the development of enzyme therapy for Gaucher disease. J Inherit Metab Dis 2001;24 Suppl 2:89-96.
4. Boot RG, Verhoek M, de Fost M, Hollak CE, Mass M, Blwijlevens B et al. Marked elevation of the chemokine CCL18/PARC in Gaucher disease: a novel surrogate marker for assessing therapeutic intervention. Blood 2004;103:33-9.
5. Deegan PB, Cox T. Clinical evaluation of biomarkers in Gaucher disease. Acta Paediatr 2005; 94(Suppl 447):47-50.
6. Aerts JMFG, Hollak CEM, van Breemen, Maas M, Groener JEM, Boot RG. Identification and use of biomarkers in Gaucher disease and other lysosomal storage diseases. Acta Paediatr 2005;94(Suppl 447): 43-6.
7. Brady RO, Gal AE, Bradley RM, Martensson E, Warshaw AL, Laster L. Enzymatic defect in Fabry disease. Ceramide-trihexosidase deficiency. N Engl J Med 1967;276:1163-7.
8. MacDermot KD, Holmes A, Miners AH. Anderson- Fabry disease: clinical manifestation and impact of disease in a cohort of 60 obligate carrier females. J Med Genet 2001;38:769-75.
9. Garman SC, Garboczi DN. The molecular defect leading to Fabry disease: structure of human _-galactosidase. J Mol Biol 2004;337:319-35.
10. Millis K, Johnson A, Winchester B. Synthesis of novel internal standards for quantitative determination of plasma ceramide trihexoside in Fabry disease by tandem mass spectrometry. FEBS Lett 2002;515: 171-6.
11. Young E. Millis K, Morris P, Vellodi A, Lee P, Walder S, Winchester B. Is globotraosylceramide a useful biomarker in Fabry diseases? Acta Paediatr 2005;94(Suppl 447):51-4.
12. Rozaklis T, Ramsay SL, Whitfield PD, Ranieri E, Hopwood JJ, Meikle PJ. Determination of oligosaccharides in Pompé disease by electrospray ionization tandem mass spectrometry. Clin Chem 2002; 48:131-9.
13. Chang MHY, Bindloss CA, Grabowski GA, Qi X, Winchester B, Hopwood JJ, Meikle PJ. Evaluation of saposins as potential diagnostic markers for lysosomal storage disorders. Clin Chem 2000;46: 167-74.
14. Meikle PJ, Brooks DA, Ravenscroft EM, Yan M, Williams RE, Jaunzems AE, Chataway TK, Krageorgos LE, Davey RC, Boulter CD, Carlsson SR, Hopwood JJ. Diagnosis of lysosomal storage disorders: evaluation of lysosome-associated membrane protein LAMP-1 as a diagnostic marker. Clin Chem 1997;43:1325-35.
15. McCandless SE. A primer on expanded newborn screening by tandem mass spectrometry. Prim Care 2004;31:583-604.
16. Millington DS. Newborn screening for lysosomal storage disorders. Clin Chem 2005;51:808-9.
17. Li Y, Scott CR, Chamoles NA, Ghavami A, Pinto BM, Turecek F, et al. Direct multiplex assay of lysosomal enzymes in dried blood spots for newborn screening. Clin Chem 2004;50:1785-6.